無熒光性新型SHG成像用染料

Ap3, SHG成像染料

Ap3是一種無熒光性SHG染料，在SHG信號成像中不會發出障礙性熒光。它與常規的熒光性膜染色染料不同，可以只觀察細胞膜的信號，因此能夠用于分析細胞膜的準確位置。另外，由于SHG信號強度和膜電位相關，因此還能用于膜電位的成像。

※ 本產品僅供科研用，不可作其他用途。

※ 本產品基于慶應義塾大學 醫學部藥理學教室以及筑波大學 數理物質系（學際物質科學研究中心）的研究成果，由funakoshi進行商品化并銷售。

※ Nuriya M.,?et al, Nat. Commun.,?7:11557 (2016).

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使用SHG專用染料對細胞膜現象進行成像

利用雙光子現象之二次諧波產生（Second Harmonic Generation: SHG）

在顯微鏡下測量細胞膜形態和變化

慶應義塾大學 醫學部藥理學教室 塗谷睦生 老師

【背景】

細胞膜分隔細胞內外，可以作為在其周邊產生的電信號和化學信息的傳遞場所，因此在細胞間和細胞內的信息傳遞中起著十分重要的作用。但是，由于其結構的精細和復雜性等，難以進行生理學上的分析。研究發現，對細胞膜具有高親和力的染料在細胞膜中會發出強烈的SHG信號，由于該信號會根據膜電位而變化，因此研究認為，SHG成像在細胞膜的標記及其電位變化的分析等方面非常有效。

【無熒光性SHG專用染料Ap3】

Ap3是為了SHG成像而開發和合成的一種新型的無熒光性SHG專用染料，使用這種染料可實現觀察其他熒光染料的同時觀測。利用這一點，使用Ap3進行SHG成像可以觀察到響應神經活動引起的膜電位變化，同時通過鈣敏感性染料的熒光成像，還可以觀察到膜附近鈣濃度的變化。研究表明，使用Ap3進行的成像，由于光照射引起的信號衰減和細胞毒性非常低。因此利用Ap3能夠可視化細胞膜，捕捉膜電位的變化，還可能同時對熒光蛋白的動態和報告熒光染料的信號變化進行長時間成像。因而使用Ap3對腦細胞、包括肌細胞在內的其他興奮性細胞的生理學分析，或使用各種系統的離子通道的功能分析等的應用方面備受期待。

【展望】

除上述以外，SHG成像還可以對細胞膜的損傷和脂質成分，以及核酸或蛋白等生物分子的結構變化等多種生命現象進行高靈敏度檢測。利用具有這種特殊能力的普通多光子顯微鏡系統，即可輕松地進行SHG成像，而且通過擴展專用染料的應用性，相信SHG成像作為生命科學領域研究中的新型工具會有更進一步的發展。

◆特點

●　Ap3是SHG成像的專用染料。除 SHG信號外，不會發出熒光

●　Ap3無熒光性， SHG成像的同時還能進行鈣成像等熒光性成像的多模式成像

●　Ap3是一種光穩定性高的化合物

●　Ap3具有極低的光毒性，對細胞的損傷小

●　推薦光源：鈦藍寶石激光（波長標準：950 nm）

※ 在SHG成像中，需要雙光子激發顯微鏡、SHG信號用濾光片（例如465-485 nm的帶通濾光片）

※ 在SHG成像的觀察中，物鏡的另一側（正置顯微鏡時為下方）需要檢測系統。另外，在檢測系統一側建議使用具有光電倍增管（PMT）的顯微鏡。

◆操作方法要點

1. 在玻璃底培養皿中培養細胞；

2. 向細胞中添加終濃度為20 μM的Ap3溶液；

3. 使用雙光子激發顯微鏡進行觀察。

◆應用實例1

■　Ap3的SHG信號和無熒光性

950 nm激光照射時，通過Ap3可觀察到 SHG 信號，但未觀察到熒光信號。

■　腦切片中SHG成像的膜電位變化

A：電壓固定時SHG信號的膜電位敏感性

B：動作電位依賴性SHG信號變化（左）和通過膜片鉗測量的電位變化（右）

Nuriya M.,?et al, Nat. Commun.,?7:11557 (2016).

■　同時測量腦切片中SHG成像的膜電位變化和熒光成像的鈣濃度

在腦切片中反復施加動作電位時（左；比例尺20 mV，5 s），觀察Ap3的SHG信號和熒光性鈣檢測試劑Rhod-2的雙光子熒光信號（TPF）（右）。在成像中同時測量的膜電位變化和鈣濃度變化。

Nuriya M.,?et al, Nat. Commun.,?7:11557 (2016).

◆應用實例2

■　比較多模式雙光子顯微鏡下的細胞膜選擇性SHG成像和細胞膜熒光成像

用Ap3對表達細胞膜觀察用膜錨定GFP的細胞進行染色，同時可視化在950 nm飛秒激光照射下GFP的雙光子熒光（TPF，綠色）和Ap3的SHG（洋紅色）信號。

由于GFP信號不僅從細胞膜，還會從囊泡等許多細胞內的膜結構中發出強烈的熒光，因此難以準確地識別出細胞膜的位置。與之相對的，Ap3的 SHG 信號只能從細胞膜發出，從而可以實現細胞膜的選擇性成像和位點的準確識別。

Mizuguchi T.,?et al, iScience., Nov 30 ; 9 :359～366 (2018).

■　分析多模式雙光子顯微鏡下細胞膜正下方的囊泡動態和肌動蛋白

在表達GFP標記肌動蛋白的細胞中，分別用紅色熒光標記Dextran染色胞吞后的囊泡，用Ap3染色細胞膜，同時利用多模式雙光子顯微鏡進行可視化。

Ap3的SHG信號具有細胞膜特異性，而且可以與熒光信號分離，因此能夠通過Ap3的SHG信號準確識別細胞膜的位置，從而準確地測量從細胞膜到肌動蛋白骨架的距離。

Mizuguchi T.,?et al, iScience., Nov 30 ; 9 :359～366 (2018).

■　分析多模式雙光子顯微鏡下質膜正下方的囊泡動態和微管蛋白

在經過微管蛋白可視化試劑染色的細胞中，分別用紅色熒光標記Dextran標記胞吞后的囊泡，用Ap3標記細胞膜，利用多模式雙光子顯微鏡進行可視化。

Ap3的SHG信號具有細胞膜特異性，而且可以與熒光信號分離，因此能夠通過Ap3的SHG信號準確識別細胞膜的位置，而且可以測量從細胞膜到微管，以及細胞膜正下方囊泡移動的準確距離。

Mizuguchi T.,?et al, iScience., Nov 30 ; 9 :359～366 (2018).

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