特異性標(biāo)記、純化ER駐留蛋白的試劑盒

ER-Protein Capture Kit

ER-Protein Capture kit是一款利用熒光標(biāo)記物特異性標(biāo)記ER駐留蛋白，再使用標(biāo)簽捕獲抗體通過(guò)免疫沉淀法純化標(biāo)記蛋白的試劑盒。可用于ER相關(guān)蛋白的全面鑒定與定量分析有或無(wú)刺激（例如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激）下靶蛋白的ER駐留量。

※　本產(chǎn)品是funakoshi基于京都大學(xué)工學(xué)研究科浜地格教授、田村朋則講師的研究成果商品化銷售的產(chǎn)品。

※　本產(chǎn)品僅供研究使用。研究以外不可使用。

◆ER蛋白的回收方法與問(wèn)題點(diǎn)

ER （內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；Endoplasmic Reticulum）是一種通常在細(xì)胞內(nèi)占據(jù)約20%體積的細(xì)胞器，結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜且遍布整個(gè)細(xì)胞。ER是負(fù)責(zé)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)生物合成的中央細(xì)胞器，在多肽鏈合成、通過(guò)伴侶蛋白適當(dāng)折疊、排除異常蛋白等，從生物合成到品質(zhì)管理中起著重要作用。ER還擔(dān)任分泌路徑的一部分，是細(xì)胞膜蛋白和細(xì)胞外分泌蛋白通過(guò)的細(xì)胞器。另外，它還被認(rèn)為對(duì)于脂質(zhì)代謝和脂肪滴形成十分重要，因此能夠分離、鑒定并定量分析ER蛋白的方法備受期待。然而，不同于其他細(xì)胞器，特異性純化ER的的技術(shù)十分貧乏，選擇性回收ER蛋白并不容易。

ER Protein Capture Kit是由京都大學(xué)浜地格教授、田村朋則講師等開(kāi)發(fā)的基于ER駐留蛋白標(biāo)記技術(shù)商品化的ER蛋白選擇性標(biāo)記、純化試劑盒。通過(guò)使用ER駐留蛋白標(biāo)記試劑ERM （ER-localizable Reactive Molecule），可以利用熒光標(biāo)記物標(biāo)記ER駐留蛋白，然后通過(guò)針對(duì)該標(biāo)記物的特異性抗體進(jìn)行純化，選擇性回收ER蛋白。無(wú)需超速離心機(jī)等特殊的機(jī)器，僅需簡(jiǎn)單操作便可純化ER蛋白。除了能夠通過(guò)蛋白組學(xué)進(jìn)行全面鑒定外，本產(chǎn)品還適用于相對(duì)定量分析各種刺激處理下的ER駐留量。

◆試劑盒內(nèi)容

本試劑盒由兩部分組成。

A：ER駐留蛋白標(biāo)記試劑ERM

A：（本試劑與產(chǎn)品名稱為ERseeing、產(chǎn)品編號(hào)FDV-0038為同一試劑。可單獨(dú)購(gòu)買(mǎi)，也可以用作ER成像試劑）

B：標(biāo)簽捕獲抗體（純化兔多克隆IgG抗體）

A：※ 產(chǎn)品不包含用于細(xì)胞裂解液制備用的溶解緩沖液或免疫沉淀所需的Protein A / G樹(shù)脂等。請(qǐng)另行購(gòu)買(mǎi)。

◆原理和實(shí)驗(yàn)流程

ER駐留蛋白標(biāo)記試劑ERM是一種在ER駐留性綠色熒光色素（Rhodol衍生物）上綴合蛋白標(biāo)記基團(tuán)的化合物。將ERM添加到活細(xì)胞后，由于色素部分的特性，顯示出較高的ER駐留性。在ER中迅速濃縮后，通過(guò)蛋白標(biāo)記基團(tuán)用熒光標(biāo)記物標(biāo)記ER蛋白物（Step-1）。標(biāo)記反應(yīng)后破碎細(xì)胞制備細(xì)胞裂解液（Step-2），然后通過(guò)使用標(biāo)簽捕獲抗體（抗Rhodol抗體）進(jìn)行免疫沉淀（Step-3），可以選擇性地回收被ERM標(biāo)記的ER蛋白。由于回收的蛋白上帶有熒光基團(tuán)，使用SDS-PAGE分離后，可以通過(guò)CBB/銀染或熒光成像儀檢測(cè)出來(lái)（Step-4）。進(jìn)行SDS-PAGE分離后，可以通過(guò)LC / MS進(jìn)行全面蛋白組學(xué)分析或使用任何抗體的蛋白印跡法鑒定ER蛋白。

◆原著論文

Fujisawa et al., J. Am. Chem. Soc., 140, 17060～17070 (2018). Chemical Profiling of the Endoplasmic Reticulum Proteome Using Designer Labeling Reagents.

◆實(shí)驗(yàn)參考數(shù)據(jù)

■ ERM的激發(fā)/發(fā)射光譜

■ 激發(fā)光譜（藍(lán)）以及發(fā)射光譜（綠）

■ ※ 適用于普通的綠色熒光色素FITC觀察條件

■ ER特異性檢驗(yàn)

通過(guò)與各種細(xì)胞器標(biāo)記共染色評(píng)價(jià)本試劑的ER特異性。觀察到ERM（100 nM）與ER標(biāo)記試劑高度共定位（皮爾遜相關(guān)系數(shù)>0.9）。另一方面，未觀察到本試劑與溶酶體標(biāo)記、線粒體標(biāo)記的共定位。高爾基體標(biāo)記觀察到部分共定位，應(yīng)該是因?yàn)楸驹噭┧鶚?biāo)記的蛋白通過(guò)Golgi體運(yùn)輸從ER轉(zhuǎn)移至分泌路徑。此外，添加ER-Golgi運(yùn)輸抑制劑的話，會(huì)減少與高爾基體的共定位（詳細(xì)請(qǐng)參考原著論文）。

◆應(yīng)用實(shí)例

通過(guò)蛋白組學(xué)全面分析回收蛋白

使用ERM (100 nM)處理HeLa細(xì)胞后，破碎細(xì)胞制備細(xì)胞裂解液。在裂解液中加入標(biāo)簽捕獲抗體，使用Protein A磁珠進(jìn)行免疫沉淀回收標(biāo)記蛋白。將回收的蛋白通過(guò)SDS-PAGE分離后，切出每個(gè)條帶，在凝膠中用yidanbai酶/ Lys-C消化制備LC/MS樣品。通過(guò)MS分析鑒定出共146種蛋白，其中63種蛋白是數(shù)據(jù)庫(kù)上的ER蛋白，或是個(gè)別論文中確認(rèn)了ER駐留的蛋白。73種蛋白作為細(xì)胞膜、細(xì)胞外分泌蛋白以及高爾基體蛋白被鑒定出來(lái)，它們都是存在于細(xì)胞外分泌路徑的蛋白。由于存在于細(xì)胞外分泌途徑的蛋白會(huì)途經(jīng)ER，當(dāng)這些蛋白在ER的時(shí)候便會(huì)被標(biāo)記。因此，檢測(cè)出來(lái)的蛋白中ER蛋白與途經(jīng)ER的蛋白約占93%。本實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)出與ER無(wú)關(guān)的蛋白有10種，約占7%。

R應(yīng)激引起的ER駐留蛋白變動(dòng)量的定量評(píng)價(jià)

通過(guò)SILAC定量分析法分析ER應(yīng)激誘導(dǎo)的ER駐留蛋白的變動(dòng)量。準(zhǔn)備兩份細(xì)胞，一份在SILAC Heavy標(biāo)記培養(yǎng)基中培養(yǎng)，另一份在Light標(biāo)記培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在Heavy標(biāo)記培養(yǎng)基的細(xì)胞中添加ER應(yīng)激誘導(dǎo)試劑Tunicamycin培養(yǎng)4 h。而Light標(biāo)記培養(yǎng)基無(wú)需任何處理培養(yǎng)4 h。之后，使用ERM（100 nM）處理1 h，分別制備細(xì)胞裂解液，再以1:1的比例混合。通過(guò)免疫沉淀法回收混合裂解液中的標(biāo)記蛋白，然后與上述實(shí)驗(yàn)一樣，制備LC/MS用樣品。檢測(cè)出了87種可相對(duì)定量的蛋白，再通過(guò)SILAC法算出由ER應(yīng)激引起的變動(dòng)量。其中6種蛋白因ER應(yīng)激在ER上的存在量增加了兩倍以上。

※ 本頁(yè)面產(chǎn)品僅供研究用，研究以外不可使用。